高考真题‖2025高考生物学真题分类汇编专题十七之03 基因工程的基本操作程序及应用和蛋白质工程(2)

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说明：

    一、试卷来源于已出现在网络上的各省或全国试卷：目前主要收集到河南卷、云南卷、四川卷、陕晋青宁卷、甘肃卷、湖北卷、广东卷、北京卷、河北卷、浙江1月卷、黑吉辽蒙卷、江苏卷、安徽卷、湖南卷、山东卷、重庆卷和全国卷，尚缺天津卷、海南卷、上海卷、浙江6月卷、江西卷、福建卷、广西卷、贵州卷等，后期补充。

    二、同一试题可能存在多个知识考点，也就会出现在不同的专题中，请注意辨别。

2025高考生物学真题分类汇编

专专题17 基因工程

考点03 基因工程的基本操作程序及应用和蛋白质工程

10．（2025·黑吉辽蒙卷）香树脂醇具有抗炎等功效，从植物中提取难度大、产率低。通过在酵母菌中表达外源香树脂醇合酶基因N，可高效生产香树脂醇。回答下列问题。

(1)可从中查询基因N的编码序列，设计特定引物。如图1所示，a链为转录模板链，为保证基因N与质粒pYL正确连接，需在引物1和引物2的5'端分别引入和限制酶识别序列。PCR扩增基因N，特异性酶切后，利用连接DNA片段，构建重组质粒，大小约9.5kb（kb为千碱基对），假设构建重组质粒前后，质粒pYL对应部分大小基本不变。

(2)进一步筛选构建的质粒，以1-4号菌株中提取的质粒为模板，使用引物1和引物2进行PCR扩增，电泳PCR产物，结果如图2。在第5组的PCR反应中，使用无菌水代替实验组的模板DNA，目的是检验PCR反应中是否有的污染。初步判断实验组（从“1~4”中选填）的质粒中成功插入了基因N，理由是。

(3)为提高香树脂醇合酶催化效率，将编码第240位脯氨酸或第243位苯丙氨酸的碱基序列替换为编码丙氨酸的碱基序列，丙氨酸的密码子有GCA等。a是诱变第240位脯氨酸编码序列的引物（GCA为诱变序列），b、c、d其中一条是诱变第243位苯丙氨酸的引物，其配对模板与a的配对模板相同。据此分析，丙氨酸的密码子除GCA外，还有。

a：5'-…GCA/CCC/GAG/TTC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC…-3'

b：5'-…GAA/CTG/TGG/GAC/ACC/CTG/AAC/TAC/TTC/TCT/GAG…-3'

c：5'-…GCC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC/CCC/TAC/CAC…-3'

d：5'-…GAT/AAT/AAG/ATC/CGA/GAG/AAG/GCC/ATG/CGA/AAG…-3'

(4)进一步检测转基因酵母菌发酵得到的含量并进行比较，可以选出最优的香树脂醇合酶基因的改造方案。

11．（2025·四川卷）杆菌M2合成的短肽拉索西丁能有效杀死多种临床耐药细菌。拉索西丁能与细菌的核糖体结合，阻止携带氨基酸的tRNA进入核糖体位点2。有人将合成拉索西丁的相关基因（lrcA-lrcF）导入链霉菌，基因克隆流程及拉索西丁的作用机制如下图。回答下列问题。

注：①F1、F2、F3和F4为与相应位置的DNA配对的单链引物，“→”指引物5-3方向。②密码子对应的氨基酸：AAA-赖氨酸；AUG-甲硫氨酸（起始）；UUC-苯丙氨酸；ACA-苏氨酸：UCG-丝氨酸。

(1)用PCR技术从杆菌M2基因组中扩增lrcA-lrcF目的基因时，应选用引物。本研究载体使用了链霉菌的复制原点，其目的是。

(2)采用EcoRI和BamHI完全酶切构建的重组质粒，产物通过琼脂糖凝胶电泳检测应产生条电泳条带，电泳检测酶切产物的目的是。

(3)由图可知，拉索西丁与核糖体结合后，会阻止携带（填氨基酸名称）的tRNA进入结合位点，导致，最终引起细菌死亡。

(4)重组链霉菌的目的基因产物经验证有杀菌活性，但重组菌在实验室多次培养后，提取的目的基因产物杀菌活性丧失，可能的原因是。若运用发酵工程来生产拉索西丁工程药物，除产物活性外还需进一步研究的问题有（答出1点即可）。

12．（2025·河北卷）T-DNA插入失活是研究植物基因功能的常用方法，研究者将带有卡那霉素抗性基因的T-DNA插入拟南芥2号染色体的A基因内，使其突变为丧失功能的a基因，花粉中A基因功能的缺失会造成其不育。回答下列问题：

(1)基因内碱基的增添、缺失或都可导致基因突变。

(2)以Aa植株为（填“父本”或“母本”）与野生型拟南芥杂交，F₁中卡那霉素抗性植株的占比为0，其反交的F₁中卡那霉素抗性植株的占比为。

(3)为进一步验证基因A的功能，将另一个A基因插入Aa植株的3号染色体。仅考虑基因A和a，该植株会产生种基因型的可育花粉，其中具有a基因的花粉占比为。该植株自交得到F_1。利用图1所示引物P1和P2、P1和P3分别对F₁进行PCR检测，电泳结果如图2所示。根据电泳结果F₁植株分为Ⅰ型和Ⅱ型，其中Ⅰ型植株占比为。F₁中没有检测到仅扩增出600bp条带的植株，其原因为。

(4)实验中还获得了一个E基因被T-DNA插入突变为e基因的植株，e基因纯合的种子不能正常发育而退化。为分析基因E/e和A/a在染色体上的位置关系，进行下列实验：

①利用基因型为AaEE和AAEe的植株进行杂交，筛选出基因型为的F₁植株。

②选出的F₁植株自交获得F_2．不考虑其他突变，若F₂植株中花粉和自交所结种子均发育正常的植株占比为0，E/e和A/a在染色体上的位置关系及染色体交换情况为；若两对基因位于非同源染色体，该类植株的占比为。除了上述两种占比，分析该类植株还可能的其他占比和原因：。

13．（2025·山东卷）种子休眠是抵御穗发芽的一种机制。通过对Ti质粒的改造，利用农杆菌转化法将Ti质粒上的T-DNA随机整合到小麦基因组中，筛选到2个种子休眠相关基因的插入失活纯合突变体。与野生型相比，突变体种子的萌发率降低。小麦基因组序列信息已知。

(1)Ti质粒上与其在农杆菌中的复制能力相关的结构为。选用图甲中的SmaI对抗除草剂基因X进行完全酶切，再选择SmaI和对Ti质粒进行完全酶切，将产生的黏性末端补平，补平时使用的酶是。利用DNA连接酶将酶切后的包含抗除草剂基因X的片段与酶切并补平的Ti质粒进行连接，构建重组载体，转化大肠杆菌；经卡那霉素筛选并提取质粒后再选用限制酶进行完全酶切并电泳检测，若电泳结果呈现一长一短2条带，较短的条带长度近似为bp，则一定为正向重组质粒。

(2)为证明这两个突变体是由于T-DNA插入到小麦基因组中同一基因导致的，提取基因组DNA，经酶切后产生含有T-DNA的基因组片段（图乙）。在此酶切过程中，限于后续PCR难以扩增大片段DNA，最好使用识别序列为（填“4”“6”或“8”）个碱基对的限制酶，且T-DNA中应不含该酶的酶切位点。需首先将图乙的片段，才能利用引物P1和P2成功扩增未知序列。PCR扩增出未知序列后，进行了一系列操作，其中可以判断出2条片段的未知序列是否属于同一个基因的操作为（填“琼脂糖凝胶电泳”或“测序和序列比对”）。

(3)通过农杆菌转化法将构建的含有野生型基因的表达载体转入突变植株，如果检测到野生型基因，（填“能”或“不能”）确定该植株的表型为野生型。

14．（2025·安徽卷）稻瘟病是一种真菌病害，水稻叶片某些内生放线菌对该致病菌有抑制作用。科研小组分离筛选出内生放线菌，并开展了相关研究。回答下列问题。

(1)采集有病斑的水稻叶片，经表面消毒、研磨处理，制备研磨液。此后，采用（填方法）将研磨液接种于不同的选择培养基，分别置于不同温度下培养，目的是。

(2)经筛选获得一株内生放线菌，该菌株高效合成铁载体小分子，能辅助内生放线菌吸收铁离子。R基因是合成铁载体的关键基因之一。科研小组构建R基因敲除株，探究铁载体的功能。主要步骤如下：首先克隆R基因的上游片段R-U和下游片段R-D；然后构建重组质粒；最后利用重组质粒和内生放线菌DNA片段中同源区段可发生交换的原理，对目标基因进行敲除。如图1所示。

采用PCR技术鉴定R基因的敲除结果。PCR通过变性、复性和延伸三步，反复循环，可实现基因片段的。R基因敲除过程中，可发生多种形式的同源区段交换，PCR检测结果如图2所示，其中R基因敲除株为菌落（填序号），出现菌落④的可能原因是。

(3)内生放线菌和稻瘟病致病菌的生长均需要铁元素。科研小组推测该内生放线菌通过对铁离子的竞争性利用，从而抑制稻瘟病致病菌生长。设计实验验证该推测，简要写出实验思路。

15．（2025·浙江卷）3-磷酸甘油脱氢酶（GPD）是酵母细胞中甘油合成的关键酶。利用某假丝酵母菌株为材料，克隆具有高效催化效率的3-磷酸甘油脱氢酶的基因（Gpd）。采用的方案是：先通过第1次PCR扩增出该基因的中间部分，再通过第2次PCR分别扩增出该基因的两侧，经拼接获得完整基因的序列，如图所示，回答下列问题：

(1)分析不同物种的GPD蛋白序列，确定蛋白质上相同的氨基酸区段，依据这些氨基酸所对应的，确定DNA序列，进而设计1对引物。以该菌株基因组DNA为模板进行第1次PCR，利用凝胶电泳分离并纯化DNA片段，进一步测定PCR产物的序列。在制备PCR反应体系时，每次用微量移液器吸取不同试剂前，需要确认或调整刻度和量程，还需要。

(2)若在上述PCR扩增结果中，除获得一条阳性条带外，还出现了另外一条条带，不可能的原因是__________。

A．DNA模板被其他酵母细胞的基因组DNA污染

B．每个引物与DNA模板存在2个配对结合位点

C．在基因组中Gpd基因有2个拷贝

D．在基因组中存在1个与Gpd基因序列高度相似的其他基因

(3)为获得完整的Gpd基因，分别用限制性核酸内切酶PstⅠ和SalⅠ单酶切基因组DNA后，各自用DNA连接酶连接形成环形DNA，再用苯酚-氯仿抽提除去杂质，最后加入沉淀环形DNA。根据第一次PCR产物测定获得的序列，重新设计一对引物，以环形DNA为模板进行第二次PCR，最后进行测序。用于第二次PCR的一对引物，其序列应是DNA链上的（A．P1和P2B．P3和P4 C．P1和P4 D．P2和P3）。根据测序结果拼接获得完整的Gpd基因序列，其中的启动子和终止子具有功能。

(4)为确定克隆获得的Gpd基因的准确性，可将获得的基因序列与已建立的进行比对。将Gpd基因的编码区与连接，构建重组质粒，再将重组质粒导入酿酒酵母细胞中，实现利用酿酒酵母高效合成甘油的目的。

16.（2025·全国新课标理综卷）(12分)为在大肠杆菌中表达酶X，某同学将编码酶X的基因(目的基因)插入质粒Po，构建重组质粒Px，并转入大肠杆菌。该同学设计引物用PCR方法验证重组质粒构建成功(引物1~4结合位置如图所示，→表示引物5’→3’方向)。回答下列问题:

(1)PCR是根据DNA复制原理在体外扩增DNA的技术。在细胞中DNA复制时解开双链的酶是____________，而 PCR过程中解开双链的方法是________________________。

(2)PCR过程中，因参与合成反应、不断消耗而浓度下降的组分有___________________。

(3)该同学进行PCR实验时，所用模板与引物见下表。实验中①和④的作用是__________________;②无扩增产物，原因是_______________________________;③、⑤和⑥有扩增产物，扩增出的DNA产物分别是____________________________________。

(4)设计实验验证大肠杆菌表达的酶X有活性，简要写出实验思路和预期结果。

17.（2025·重庆卷）绝大多数哺乳动物生来怕辣，而小型哺乳动物树鼩先天不怕辣，喜食含辣椒素类物质的植物。为探究其原因，我国研究人员进行了系列研究。

（1）研究发现，树鼩的受体蛋白TR1对辣椒素的敏感性低于其他哺乳动物。为研究树鼩和其他哺乳动物TR1蛋白的差异，可设计开展如下实验：

①________；

②将_______分别进行酶切并连接；

③将重组DNA分子导入大肠杆菌；

④分离表达的TR1蛋白质测定_______，明确蛋白之间的差异。

（2）树鼩及一些哺乳动物的TR1蛋白存在差异，如图所示。据分析，树鼩对辣椒素的敏感性降低，很可能是由于TR1第579位氨基酸差异造成的，可证实该推测的实验思路是________。

（3）树鼩与其喜食植物的地理分布基本一致，据此可推测树鼩对含辣椒素类物质植物的适应形成的必要条件是________。

参考答案

10.【答案】

(1)基因数据库/序列数据库 Xho Ⅰ     Xba Ⅰ     DNA 连接酶

(2)外源DNA 1     目的基因N大小为2.3kb

(3)GCC

(4)香树脂醇

11.【答案】

(1)F2、F4 保证载体能在链霉菌细胞中能正常复制

(2)2 验证重组质粒是否构建成功

(3)苯丙氨酸或phe 翻译受阻

(4)目的基因发生突变或变异 发酵条件优化

12.【答案】

(1)替换

(2)父本 1/2

(3)3 1/3     2/3     a花粉不育，无法形成纯合aa植株

(4)AaEe E/e和A/a连锁且无交换，F₂中无同时含A和E的配子     1/6     若基因连锁但发生交换，正常植株占比介于0～1/6

13.【答案】

(1)复制原点 XbaI     DNA聚合酶     SmaI和SpeI     550bp

(2)4 环化     测序和序列比对

(3)不能

14.【答案】

(1)稀释涂布平板法 分离不同条件下生长的内生放线菌

(2)指数级扩增 ②重组质粒通过（单交换）同源重组整合到了内生放线菌的基因组中

(3)设置两组培养实验：对照组在低（或常规）铁浓度的培养基上进行，实验组在高铁浓度的培养基上进行。在两组培养基的相同位置分别接种内生放线菌和稻瘟病致病菌。在相同且适宜的条件下培养一段时间后，观察并比较两组中稻瘟病致病菌菌落的生长情况（如菌落大小或抑制圈大小）。若高铁组的抑制效果明显弱于低铁组，则支持该推测。

15.【答案】

(1)密码子/遗传密码     琼脂糖     更换微量移液器的枪头

(2)C

(3)预冷的体积分数为95%的酒精 C     调控

(4)基因数据库/序列数据库 表达载体

16.【答案】

（1）解旋酶 高温变性    

（2）引物、脱氧核苷三磷酸 

（3）作为对照（或答:鉴定反应体系是否有模板污染） P0不含与引物1和引物2互补的碱基序列    目的基因、质粒片段、含目的基因和部分质粒序列的片段    

（4）提取酶X，催化相应底物（反应物）的反应，检测是否有产物生成。有产物生成，则证明酶X有活性

17.【答案】

（1）克隆树鼩和其他哺乳动物的TR1基因 目的基因与载体    氨基酸序列    

（2）利用基因编辑技术改变树鼩的TR1基因，使编码的TR1蛋白的第579位氨基酸由M变为T，检测树鼩对辣椒素的敏感性是否提高。 

（3）树鼩群体出现可遗传的变异和含辣椒素类植物对树鼩的定向选择

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