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稻瘟病是一种真菌病害，水稻叶片某些内生放线菌对该致病菌有抑制作用。科研小组分离筛选出内生放线菌，并开展了相关研究。回答下列问题。
（1）采集有病斑的水稻叶片，经表面消毒、研磨处理，制备研磨液。此后，采用________（填方法）将研磨液接种于不同的选择培养基，分别置于不同温度下培养，目的是________。
（2）经筛选获得一株内生放线菌，该菌株高效合成铁载体小分子，能辅助内生放线菌吸收铁离子。R基因是合成铁载体的关键基因之一。科研小组构建R基因敲除株，探究铁载体的功能。主要步骤如下：首先克隆R基因的上游片段R-U和下游片段R-D；然后构建重组质粒；最后利用重组质粒和内生放线菌DNA片段中同源区段可发生交换的原理，对目标基因进行敲除。如图1所示。
采用PCR技术鉴定R基因的敲除结果。PCR通过变性、复性和延伸三步，反复循环，可实现基因片段的________。R基因敲除过程中，可发生多种形式的同源区段交换，PCR检测结果如图2所示，其中R基因敲除株为菌落________（填序号），出现菌落④的可能原因是________。
参考答案
(1)稀释涂布平板法；筛选出不同条件下的内生放线菌
(2)扩增；②；重组质粒和内生放线菌R基因组合在一起,形成了7000bp的DNA片段
解析
(1)研磨液里含有内生放线菌,可用稀释涂布平板法将研磨液接种于不同的选择培养基上进行筛选。经过一段时间培养后,在适宜的温度下,可以形成内生放线菌的菌落,从而分离纯化出内生放线菌。
(2)PCR的原理是体外DNA半保留复制,可实现基因片段的大量扩增。结合图1和图2可知,菌落①③PCR物长度都是3000p,正好是R基因的长度,说明R基因没有敲除成功。菌落②PCR产物长度是1000bp,说明敲除了R基因中间序列,保留了两端序列,R基因敲除成功。菌落④PCR产物长度是7000bp,正好是重组质粒(4000bp)和R基因(3000bp)的总和,说明重组质粒和内生放线菌R基因组合在一起,形成了7000bp的DNA片段。
