高考真题‖2025高考生物学真题分类汇编专题十七之03 基因工程的基本操作程序及应用和蛋白质工程(1)

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    二、同一试题可能存在多个知识考点，也就会出现在不同的专题中，请注意辨别。

2025高考生物学真题分类汇编

专专题17 基因工程

考点03 基因工程的基本操作程序及应用和蛋白质工程

一、单选题

1．（2025·安徽卷）质粒K中含有β-半乳糖苷酶基因，将该质粒导入大肠杆菌细胞后，其编码的酶可分解X-gal，产生蓝色物质，进而形成蓝色菌落，如图所示。科研小组以该质粒作为载体，采用基因工程技术实现人源干扰素基因在大肠杆菌中的高效表达。下列叙述错误的是（）

A．使用氯化钙处理大肠杆菌以提高转化效率，可增加筛选平板上白色和蓝色菌落数

B．如果筛选平板中仅含卡那霉素，生长出的白色菌落不可判定为含目的基因的菌株

C．因质粒K中含两个标记基因，筛选平板中长出的白色菌落即为表达目标蛋白的菌株

D．若筛选平板中蓝色菌落偏多，原因可能是质粒K经酶切后自身环化并导入了大肠杆菌

二、解答题

2．（2025·陕晋青宁卷）马铃薯作为重要农作物，提高其冷耐受性可拓展优质马铃薯的种植区域。我国科研人员发现，野生马铃薯中S基因的表达与其冷耐受性调控有关，将该基因导入栽培马铃薯中可显著增强其抗寒能力。回答下列问题。

(1)PCR扩增目的基因时，需要模板DNA、引物、、含Mg²⁺的缓冲液和耐高温的DNA聚合酶。DNA聚合酶在PCR的步骤中起作用。

(2)图中标识了载体和S基因中限制酶的切割位点。为将S基因正确插入载体，PCR扩增S基因时需在引物的（填“5'端”或“3'端”）添加限制酶识别序列，结合上表分析，上游引物应添加的碱基序列是5'--3'，切割载体时应选用的两种限制酶是，PCR扩增产物和载体分别被限制酶切割后，经纯化和连接，获得含S基因的表达载体并导入农杆菌。

(3)用携带S基因的农杆菌侵染栽培马铃薯愈伤组织时，基因表达载体中T-DNA进入愈伤组织细胞，将S基因整合到，抗性基因可用于筛选成功转化的愈伤组织。该愈伤组织经形成芽、根，继续培育可获得抗寒能力显著增强的马铃薯植株。

3．（2025·广东卷）大肠杆菌是重要工业菌株之一，其培养过程可分为快速生长期和生长稳定期两个阶段。为了通过调节蛋白质合成与降解速率来动态调控代谢途径关键酶的蛋白量，使细胞适配不同阶段的生产需求，研究者设计了两种质粒，并以稳定性好的红色荧光蛋白mKate2为模式蛋白。测试质粒功能。回答下列问题：

(1)研究者首先构建质粒①（图a）用于在细胞内表达C-末端带SsrA短肽的mKate2，将质粒导入感受态细胞后，在添加抗生素的选择培养基上培养。根据培养基上菌落的生长状况，结合PCR及检测，筛选获得重组菌株W1。

(2)将W1在适宜条件下进行摇瓶培养，定时取样检测培养液中细胞密度，方法有（答一种）。接种前需检测液体培养基的荧光强度，其作用是。培养结果（图b）表明，进入生长稳定期后荧光强度快速下降，原因是。

(3)研究者选用启动子P_X、X基因（编码阻遏蛋白X，阻遏P_X开启转录），重新构建质粒②（图a），导入野生型大肠杆菌中获得重组菌株W2。在适宜条件下摇瓶培养，W2的生长趋势不变，培养期间荧光强度的变化趋势为。

(4)莽草酸是一种重要工业化学品，其胞内合成代谢途径见图c。由于野生型大肠杆菌胞内酶A活性弱，且莽草酸会被快速转化为细胞生长必需物，因此细胞中无法大量积累莽草酸。为了保证细胞正常生长，并在生长稳定期实现莽草酸的大量积累，利用上述两种质粒的调控功能，结合野生型菌株遗传物质的改造，提出重组生产菌株构建思路：。

4．（2025·云南卷）我国研究人员发明了生产维生素C的两步发酵法，流程如图甲。为了减少氧化葡糖杆菌竞争性消耗山梨糖，需要进行灭菌以结束第一步发酵。

在两步发酵法的基础上，我国研究人员进一步尝试用三菌混菌体系建立一步发酵法。在氧化葡糖杆菌（原始菌MCS）中利用基因工程技术导入大肠杆菌基因ccdB，得到工程菌IR3C。MCS和IR3C单菌培养时，活菌数变化曲线如图乙，MCS、IR3C分别与普通生酮基古龙酸菌和巨大芽孢杆菌进行三菌混菌发酵时，产物含量变化曲线如图丙。

回答下列问题：

(1)要使基因ccdB在IR3C中稳定遗传、表达并发挥作用，构建的基因表达载体除启动子外，还必须有。

(2)绘制图乙需统计活菌数，常用方法是。当活菌达到一定数量时，基因ccdB编码的蛋白质开始发挥作用，推测该蛋白质的作用是，开始发挥作用的时间是，判断理由是。

(3)基于图丙，利用IR3C三菌混菌发酵的产量（填“高于”或“低于”）MCS三菌混菌发酵的产量，其原因是。

5．（2025·甘肃卷）水稻白叶枯病（植株的叶片上会出现逐渐扩大的黄白色至枯白色病斑）由白叶枯病菌引起，严重威胁水稻生产和粮食安全。科学家利用CRISPR-Cas9基因组编辑技术，对水稻白叶枯病的感病基因SWEET（该基因被白叶枯病菌利用以侵染水稻）的启动子区进行了定点“修改”，编辑后的水稻幼胚通过植物组织培养技术获得抗病植株（如下图）。回答下列问题。

(1)CRISPR-Cas9重组Ti质粒构建完成后，可通过（方法）将该质粒转入植物细胞，并将整合到该细胞的染色体上。为了能够筛选出转化成功的细胞，需要在植物组织培养基中添加。

(2)实验中用到的水稻幼胚在植物组织培养中被称为，对其消毒时需依次使用酒精和处理。诱导形成再生植株的过程中需使用生长素和细胞分裂素，原因是。

(3)为了检测基因编辑水稻是否成功，首先需采用技术检测目标基因的启动子区是否被成功编辑；然后，在个体水平需将基因编辑后的水稻与野生型水稻分别接种白叶枯病菌，通过比较来验证抗病性。

(4)在该研究中，基因编辑成功后的水稻可以抗白叶枯病的原因为。

6．（2025·河南卷）卡拉胶是一类源于海洋红藻的大分子多糖，可被某些细菌降解为具有多种应用前景的卡拉胶寡糖。某研究小组拟筛选具有高活性卡拉胶酶（CG）的菌种用于生产卡拉胶寡糖。回答下列问题：

(1)选择海藻和海泥作为样本筛选卡拉胶降解菌的原因是。将培养后的菌液混匀并充分，再接种至微孔板中，经培养和筛选获得了CG活性最高的菌种。

(2)为构建携带cg（CG的编码基因）的大肠杆菌表达载体（图1），对cg的PCR扩增产物和质粒进行双酶切，随后用E.coliDNA连接酶连接。为保证连接准确性和效率，cg转录模板链的5'端最好含有酶切位点。另有两组同学选用了各不相同的双酶切组合和T4DNA连接酶重复上述实验，获得的部分重组质粒分子大小符合预期，但均无法使用各自构建表达载体的双酶切组合进行切割，其原因是。

限制酶的识别序列和切割位点如下：

(3)为将构建好的表达载体转入大肠杆菌，需要先用Ca²⁺处理大肠杆菌细胞，目的是，随后在含和的培养基中培养一段时间后，根据菌落周围有无水解透明圈筛选目的菌株。

(4)已知空间上邻近的两个半胱氨酸易形成二硫键，从而提升蛋白质的耐热性。为提高CG的耐热性，研究人员分析了五个氨基酸位点的空间距离和保守度（保守度值越大表明该位点对酶的功能越关键），如图2所示。根据分析结果，选择第位的氨基酸替换成半胱氨酸最合适，原因是。

7．（2025·湖南卷）非洲猪瘟病毒是一种双链DNA病毒，可引起急性猪传染病。基因A编码该病毒的主要结构蛋白A，其在病毒侵入宿主细胞和诱导机体免疫应答过程中发挥重要作用。回答下列问题：

(1)制备特定抗原

①获取基因A，构建重组质粒（该质粒的部分结构如图所示）。重组质粒的必备元件包括目的基因、限制酶切割位点、标记基因、启动子和等；为确定基因A已连接到质粒中且插入方向正确，应选用图中的一对引物对待测质粒进行PCR扩增，预期扩增产物的片段大小为bp。

②将DNA测序正确的重组质粒转入大肠杆菌构建重组菌。培养重组菌，诱导蛋白A合成。收集重组菌发酵液进行离心，发现上清液中无蛋白A，可能的原因是（答出两点即可）。

(2)制备抗蛋白A单克隆抗体

用蛋白A对小鼠进行免疫后，将免疫小鼠B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，诱导融合的常用方法有（答出一种即可）。选择培养时，对杂交瘤细胞进行克隆化培养和，多次筛选获得足够数量的能分泌所需抗体的细胞。体外培养或利用小鼠大量生产的抗蛋白A单克隆抗体，可用于非洲猪瘟的早期诊断。

8．（2025·河北卷）为治理水体中对生物有毒害的镉污染，研究者构建了分泌信号肽SP7、镉离子结合蛋白CADR、定位于细胞壁的蛋白GP1和黄色荧光蛋白YFP编码序列融合表达的载体，转入单细胞衣藻，实现CADR大量合成、分泌并定位于细胞壁，以吸附水体中的镉离子。回答下列问题：

(1)在DNA聚合酶、引物、模板DNA和脱氧核苷酸中，随着PCR反应进行，分子数量逐渐减少的是和。模板与引物在PCR反应的阶段开始结合。PCR中使用的DNA聚合酶需耐高温，其原因为。

(2)载体中可用的酶切位点信息和拟构建载体的部分结构如图1所示。在将CADR、GP1和YFP基因逐个构建到载体时，为避免错误连接，需向以上三个基因的两端分别添加限制酶识别序列，其中GPl两端应添加（填两种限制酶）的识别序列。用DNA连接酶连接时，可催化载体和目的基因之间形成键。

(3)若在荧光显微镜下观察到转基因衣藻表现为，初步表明融合蛋白表达成功。将转基因衣藻和野生型衣藻置于含镉离子的培养液中培养一段时间后，若转基因衣藻细胞壁比野生型衣藻细胞壁的镉离子含量，则表明融合蛋白能结合镉离子。

(4)将转基因衣藻和野生型衣藻在不同镉离子浓度的培养液中培养6天后，检测细胞密度，结果见图2。转基因衣藻在含有不同浓度镉离子的培养液中生长均优于野生型衣藻的原因可能是。240μmol·L^-1镉离子浓度下，转基因衣藻和野生型衣藻生长均被明显抑制的原因可能是。

(5)转基因衣藻可用于水体镉污染治理，与施加化学药物法相比，能体现出其环境治理优势的两个特性是和。（填标号）

①衣藻作为生物材料在水体中可自我繁殖②衣藻生长速率受镉离子浓度影响③衣藻可吸收水体中能引起富营养化的物质④衣藻吸附的镉可沿食物链传递

9．（2025·湖北卷）某种昆虫病毒的遗传物质为双链环状DNA．该病毒具有包膜结构，包膜上的蛋白A与宿主细胞膜上的受体结合后，两者的膜发生融合，从而使病毒DNA进入细胞内进行自我复制。回答下列问题：

(1)要清楚观察病毒的形态结构需要使用的显微镜类型是。

(2)体外培养的梭形昆虫细胞，被上述病毒感染后会转变为圆球形，原因是病毒感染引起了昆虫细胞内（填细胞结构名称）的改变。

(3)这类病毒的基因组中通常含有抗细胞凋亡的基因，这类基因对病毒的生物学意义是： 。

(4)该病毒DNA能在宿主细胞中自我复制，却无法在大肠杆菌中复制。为解决这一问题，可在该病毒的DNA中插入序列，以实现利用大肠杆菌扩增该病毒DNA的目的。

(5)用该病毒感染哺乳动物细胞，可以在细胞内检测到该病毒完整的基因组DNA，但无对应的转录产物。推测其无法转录的原因是：。

(6)采用脂溶剂处理该病毒颗粒可使病毒失去对宿主细胞的感染性，其原因是：。

参考答案

1.【答案】C

2.【答案】

(1)4种脱氧核苷酸 延伸

(2)5'端 AGATCT     BamHⅠ、EcoRⅠ

(3)栽培马铃薯愈伤组织细胞的染色体上 2     再分化

3.【答案】

(1)荧光

(2)稀释涂布平板法、显微镜直接计数法 排除培养基本身荧光对实验结果的干扰     P_Gro在生长稳定期停止基因转录，且带有SsrA短肽的mKate2被降解

(3)快速生长期无荧光，生长稳定期荧光强度先上升后保持稳定 

(4)先敲除野生菌株中的酶B基因，再将质粒①中的mKate2基因替换为酶B基因，将质粒②中的mKate2基因替换为酶A基因，并将两种质粒导入野生菌株中

4.【答案】

(1)标记基因、目的基因、终止子、复制原点

(2)稀释涂布平板法 能抑制细菌增殖    15h    在15h时，IR3C数量下降，而MSC数量上升

(3)高于 IR3C转入了ccdB基因，阻止细胞增殖，减少氧化葡糖杆菌竞争性消耗山梨糖，从而更多山梨糖被用于合成维生素C。

5.【答案】

(1)农杆菌转化法 Ti质粒上的T - DNA     潮霉素

(2)外植体 次氯酸钠     生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂、脱分化和再分化的关键激素

(3)PCR - 测序 病斑的大小（或病斑面积、发病情况等合理答案）

(4)对感病基因SWEET的启动子区进行定点修改后，白叶枯病菌无法利用该基因侵染水稻。

6.【答案】

(1)在富含卡拉胶的环境中，存在能够分解卡拉胶的微生物的可能性较大 稀释

(2)BamHI 重组质粒连接处的序列不再是原来的限制酶识别序列

(3)使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态 卡拉胶     四环素

(4)44 该位点的氨基酸空间上离半胱氨酸更近，容易形成二硫键，而且保守度低，替换后对酶功能的影响较小

7.【答案】

(1)终止子、复制原点 P1 和 P3     782     重组菌没有裂解或没有将蛋白A释放到细胞外、转速过高使蛋白A发生沉淀、蛋白A亲水性较差发生沉淀、蛋白A被大肠杆菌的蛋白酶降解

(2)聚乙二醇（PEG）融合法（或灭活病毒诱导法、电融合法） 抗体检测

8.【答案】

(1)脱氧核苷酸 引物     复性     PCR 反应需要在高温条件下进行变性步骤（90 - 95℃使双链 DNA 解旋为单链），普通的 DNA 聚合酶在高温下会变性失活，而耐高温的 DNA 聚合酶能在高温环境中保持活性，保证 PCR 反应的正常进行。

(2)SmaⅠ 和 EcoR Ⅰ 磷酸二酯键

(3)细胞表面发出黄色荧光 高

(4)转基因衣藻表达的融合蛋白能结合镉离子，降低了镉离子对衣藻的毒害作用 镉离子浓度过高，超出了融合蛋白的吸附能力，对衣藻产生了严重的毒害作用

(5)① ③

9.【答案】

(1)电子显微镜 

(2)细胞骨架

(3)抑制宿主细胞的凋亡，为病毒的复制和繁殖提供更多的时间和场所 

(4)大肠杆菌复制原点

(5)病毒基因组没有在哺乳动物细胞中表达的启动子

(6)蛋白镶嵌或贯穿于膜上，脂溶剂处理该病毒颗粒使得包膜溶解，包膜上的蛋白A游离，蛋白A与细胞膜受体结合不能使病毒DNA进入细胞内

高考真题‖2025高考生物学真题分类汇编专题十七之01 重组DNA技术的基本工具02 DNA的粗提取、PCR、电泳鉴定（1）