一、单选题 1．(高二下·福建漳州艺术实验学校·期末)研究人员利用农杆菌转化法将大豆中的耐盐碱基因（GsERF6基因）转入水稻细胞中，培育高表达GsERF6基因的耐盐碱水稻，图甲为研究人员构建的GsERF6基因表达载体，其中新霉素基因是用于筛选转化的植物细胞的标记基因；图乙为研究人员对转化的植物细胞进行目的基因检测的电泳图谱，其中M：DNAmarker；-：阴性对照；+：阳性对照；1：转基因水稻DNA。下列叙述错误的是（ ）
A．可利用含新霉素的MS培养基筛选转化的水稻细胞 B．新霉素基因和GsERF6基因的编码链在DNA的同一条链上 C．阴性对照通常选用非转基因水稻DNA，阳性对照通常选用pC35SU-GsERF6 D．据电泳图推断目的基因片段大小约为1000bp，尚需测序以确定其是否为目的基因 2．(高二下·新疆阿克苏第一中学·期末)科学家从某植物中提取乙烯受体基因（Ers1），通过基因工程技术将Ers1基因反向连接到质粒中，筛选出转入反义Ers1基因的该种植物，其果实的储藏期将延长，过程如图所示。下列相关叙述错误的是（ ）
A．PCR扩增时，需在Ers1基因左右两端分别添加XhoI、HpaI酶切序列 B．筛选农杆菌的培养基中可加入潮霉素，过程④包括脱分化和再分化 C．转基因植物中反义Ers1基因和Ers1基因分别转录出的mRNA碱基序列能互补 D．若目的基因成功转入植物细胞中，则可检测到Kanr和hyg的表达产物 3．(高二下·宁夏固原·期末)红梅杏是固原市的特色水果之一，带动了当地农民的收入。其色泽鲜艳、富含果糖和葡萄糖以及人体需要的微量元素、成熟期能保留足够的水分而口感鲜嫩，因此享誉全国。有人试图利用苏云金芽孢杆菌Bt毒蛋白基因培育抗虫红梅杏，以降低生产成本和环境污染，设计了如下图的方案。下列有关该研究说法错误的是（ ）
A．通过基因工程技术培育的抗虫红梅杏，有利于保护环境 B．完成过程①→②一般选用双酶切法 C．在植株⑤中检测到Bt毒蛋白基因，就代表抗虫红梅杏已经培育成功 D．过程④→⑤依据了植物体细胞全能性的原理 4．(高二下·福建泉州鲤城区福建泉州第七中学·期末)限制性内切核酸酶是基因工程中常用的一种酶。以下是6种不同限制酶的识别序列和切割位点，下列叙述错误的是（ ）
注：箭头表示识别序列中切断部位。 A．KpnI和Acc65I切割形成的黏性末端相同 B．BamHI与MboI切割后的产物可以通过DNA连接酶连接，连接后序列可能无法被BamHI再次切开 C．用EcoRI和HhaI切割获取的目的基因含有4个游离的磷酸基团，其切割过程会有4个磷酸二酯键被水解 D．若只用EcoRI限制酶对质粒和目的基因进行切割，并用DNA连接酶进行连接，切割后的质粒和目的基因都可能自我环化 5．(高二下·福建漳州第一中学·期末)干扰素是动物细胞受到病毒侵染后产生的一种糖蛋白，可对抗病毒的感染和癌症，但体外保存相当困难。下图是利用蛋白质工程设计生产干扰素的流程图，错误的是（ ）
A．构建新的干扰素模型的主要依据是蛋白质的预期功能 B．改造干扰素结构的实质是改造干扰素基因的结构 C．上述技术环节中，有些需要通过基因工程实现 D．新的干扰素基因应插入质粒上的起始密码子和终止密码子之间 6．(高二下·福建泉州鲤城区福建泉州第七中学·期末)科学家将苏云金杆菌中的Bt抗虫蛋白基因（抗虫基因）导入棉花的愈伤组织细胞，鉴定后，将含抗虫基因的受体细胞组织培养获得棉花植株。经棉铃虫饲喂实验，发现棉花植株并无抗虫性状，科学家提取棉花叶片细胞中的有关成分进行了如下操作，下列分析正确的是（ ） A．提取细胞中的蛋白质，采用抗原—抗体杂交技术进行检测，若能检测到Bt抗虫蛋白，则可能是抗虫基因能翻译，但不能转录 B．若经A检测确定细胞中无Bt抗虫蛋白，可采用PCR等技术检测细胞中的RNA，若测到Bt抗虫蛋白的mRNA，则可能是抗虫基因无法表达 C．若经B检测确定细胞中无Bt抗虫蛋白的mRNA，可采用PCR等技术检测细胞中的DNA，若能检测到抗虫基因，则可能是抗虫基因反向插入载体DNA分子中 D．若经C检测确定细胞中无Bt抗虫蛋白和无Bt抗虫蛋白的mRNA，则可能是将没有目的基因的载体DNA分子导入受体细胞 7．(高二下·福建泉州鲤城区福建泉州第七中学·期末)如图是被农杆菌侵染的水稻植株的DNA片段，研究者将其连接成环并以此环为模板进行PCR，扩增出T-DNA插入位置两侧的未知序列，据此来确定T-DNA插入的具体位置。下列叙述正确的是（ ）
A．农杆菌在自然条件下主要侵染单子叶植物和裸子植物，T-DNA存在于其拟核上 B．将扩增出的未知序列与水稻基因组序列比对可确定T-DNA的插入位置 C．利用图中的引物②③组合可扩增出两侧的未知序列 D．若用PCR技术扩增循环n次，需要2n-1个引物 8．(高二下·吉林长春外五县·期末)下图表示PCR过程中某个阶段反应体系的情况，①②③④表示相关物质，L、R表示方向。下列叙述错误的是（ ）
A．PCR过程每次循环分3步，其中温度最低的是复性 B．以1个DNA为模板经3次循环需消耗7个引物③ C．②链从L到R的方向为3'→5′，①②链均可作为子链合成的模板 D．物质③的5'端添加了某序列，至少需经2次循环才可获得该序列的双链产物 9．(高二下·陕西西安新城区·期末)蛋白酶抑制剂基因转化是作物抗虫育种的新途径。某研究团队将胰蛋白酶抑制剂（NaPI）和胰凝乳蛋白酶抑制剂（StPinlA）的基因单独或共同转化棉花，获得了转基因植株。如图为三种不同遗传操作产生的转基因棉花抗虫实验结果。下列有关说法错误的是（ ）
A．该抗虫机制可能是抑制害虫的食物消化从而使其死亡 B．此实验中的因变量是棉花植株所含的基因种类和饲喂时间 C．根据虫体质量和每株棉铃数量判断，NaPI+StPinlA组抗虫效果最佳 D．将抗虫基因传入植物体内时，除了采用花粉管通道法外，还可以采用农杆菌转化法 10．(高二下·辽宁丹东·期末)通过人工合成Bt基因部分序列与天然Bt基因的另一部分序列进行拼接构成重组的Bt基因，将之与T-DNA构成穿梭质粒，可提高农杆菌的转化效率，大大提高了培育抗虫棉的成功率，过程如下图。下列相关叙述正确的是（ ）
A．如图过程是对基因进行操作，因而不属于蛋白质工程 B．本实例是将重组质粒直接导入棉花愈伤组织细胞，再进行组织培养获得抗虫棉 C．本实例中，可用卡那霉素和潮霉素B初步筛选转化的棉花愈伤组织细胞 D．通过该过程能定向改造抗虫蛋白分子的结构，使之更加符合人类需要 11．(高二下·宁夏银川一中·期末)下图为利用PCR技术扩增特定DNA片段的部分示意图，图中引物为单链DNA片段，它是子链合成延伸的基础。下列有关描述错误的是（ ）
A．延伸过程中，需要DNA聚合酶、ATP和4种核糖核苷酸 B．引物是子链合成延伸的基础，子链沿着模板链的3'→5'方向延伸 C．在第三轮循环产物中才开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段且占1/4 D．利用PCR技术扩增目的基因时不需要解旋酶，引物A延伸需要耐高温的DNA聚合酶 12．(高二下·辽宁大连·期末)某DNA分子上有4个Sau3AI的酶切位点，经Sau3AI处理后会形成4个大小不同的片段；若用BamHI处理，则只会形成2个大小不同的片段。Sau3AI和BamHI的识别序列及切割位点如下表所示。下列叙述正确的是（ ） A．Sau3AI和BamHI切割产生的不全是黏性末端 B．该DNA分子上有一个BamHI的酶切位点 C．用两种酶共同处理该DNA分子，会形成4个片段 D．Sau3AI和BamHI切割产生的片段能够相连，但重组片段不能再被二者切割 13．(高二下·山东威海·期末)重叠延伸PCR是一种能够在体外实现不同来源DNA片段定向重组的技术。具体原理是：通过利用具有互补末端的引物，使PCR产物形成重叠链，借助重叠链的延伸将不同来源的扩增片段重叠拼接起来，其过程如下图所示。下列说法错误的是（ ）
A．PCR1与PCR2反应体系中的模板与引物种类不同 B．PCR3反应体系中经变性和复性后的DNA单链理论上有4种结合的可能 C．重叠链延伸生成融合基因时需要加入引物 D．PCR4中需要添加的引物是引物1和4 14．(高二下·福建福州福清·期末)我国科研人员将寒带地区海鱼中的抗冻基因转入千禧果（番茄品种）细胞中，成功培育出抗冻千禧果。下图为培育过程使用的Ti质粒示意图，Vir区的基因活化能促进T-DNA的加工和转移。下列叙述错误的是（ ）
A．可用PCR技术检测抗冻基因在受体细胞中是否转录 B．选择图示Ti质粒构建基因表达载体，应选择限制酶III C．利用PCR从海鱼中扩增抗冻基因需要添加一对特异性引物 D．要用含有卡那霉素的选择培养基筛选含抗冻基因的番茄细胞 15．(高二下·福建福州福清·期末)某线性DNA分子含有5000个碱基对(bp)，先用限制酶a完全切割，再把得到的产物用限制酶b完全切割，得到的DNA片段大小如下表。限制酶a和b的识别序列和切割位点如下图所示。下列有关叙述正确的是（ ）
A．限制酶a和b切出的DNA片段能相互连接后可被限制酶a识别切割 B．限制酶切割DNA分子一次可断开1个磷酸二酯键产生1分子水 C．仅用限制酶b切割该DNA分子可得到三种不同的DNA片段 D．该DNA上含有3个a酶的切割位点，5个b酶的切割位点 16．(高二下·天津红桥区·期末)干扰素是一种广谱抗病毒制剂；是具有多种功能的活性蛋白质（主要是糖蛋白），下图为通过基因工程生产干扰素的部分操作，图中①②③④表示相关操作过程。下列相关分析错误的是（ ）
A．过程①可以用PCR技术获取干扰素基因 B．过程②需用耐高温的DNA聚合酶和引物 C．过程③操作要注意干扰素基因应包含启动子、终止子及标记基因等结构 D．过程④为目的基因的导入，最后必须对干扰素进行功能活性鉴定 二、多选题 17．(高二下·吉林长春外五县·期末)研究发现，大豆GmNF-YA19基因在干旱胁迫中有响应。科研人员利用PCR扩增GmNF-YA19基因（如图1），构建GmNF-YA19基因表达载体（如图2）并转化烟草。下列叙述错误的是（ ）
A．应选用限制酶KpnI和EcoRI切割含目的基因的DNA片段和载体 B．启动子为位于基因上游的DNA片段，是DNA聚合酶识别和结合的部位 C．终止子为一段DNA序列，其作用是使转录在所需要的地方停下来 D．正确导入GmNF-YA19基因的细胞可在含有氨苄青霉素的培养基中生长 18．(高二下·山东东营·期末)利用小球藻生产生物柴油，具有广阔的开发利用前景。科学家从酵母菌中提取DGAT基因（DGAT：二酸甘油酰基转移酶，合成油脂重要基因），导入到小球藻中增强小球藻油脂代谢途径，最终获得高产油脂小球藻。已知质粒上EcoRI酶切位点与XbaI酶切位点间最短间隔为300bp。下列说法正确的是（ ）
A．扩增产物的长度决定PCR延伸的时间，引物的G/C含量决定复性的温度 B．若采用PCR技术对一个DGAT基因进行扩增，则复制n代共需要引物2n+1-2个 C．pB121载体中使用酵母菌的启动子可让DGAT基因在小球藻中更好表达 D．由电泳结果可知a为构建成功的重组质粒，b为未连接目的基因的空质粒 19．(高二下·四川绵阳外国语学校·期末)某线性DNA分子含有5000个碱基对（bp），先用a酶切割，把得到的产物用b酶切割，得到的DNA 片段大小如下表所示。a酶和b酶的识别序列和切割位点如下图所示。下列有关说法错误的是（ ）
A．在该DNA分子中，a酶与b酶的识别序列均为3个 B．同时使用酶a和酶b对目的基因所在的片段和质粒进行切割，可保证二者正确连接 C．a酶与b酶切出的黏性末端相互连接后的序列不可再被a酶切割 D．仅用a酶切割该DNA分子需要消耗6个水分子，增加了3个游离的磷酸基团 20．(高二下·河北衡水枣强中学·期末)Ti质粒的Vir基因表达产生的Vir蛋白能在T-DNA左右边界序列中产生切口，并复制出单链T-DNA从Ti质粒上释放后进入植物细胞。T-DNA左右边界序列与植物细胞DNA分子中某些序列有极强的同源性，因此可以插入植物细胞基因组中。T-DNA的生长素基因和细胞分裂素基因能使植物组织过度生长。形成瘤状组织（冠瘿），影响植物的正常生理功能。冠瘿碱合成基因使植物细胞合成并分泌冠瘿碱（一种氨基酸衍生物），为农杆菌的生长提供碳源和氮源。下列叙述正确的是（ ）
A．Ti质粒中的冠瘿碱合成基因与植物细胞染色体DNA整合后，其最终表达产物可用来催化合成冠瘿碱 B．为保证转基因植物正常生长，Ti质粒作载体时需将生长素基因和细胞分裂素基因敲除 C．应将目的基因插入Ti质粒的T-DNA上·且不能破坏左右边界序列 D．Ti质粒作为基因工程载体时，需将Vir基因替换成标记基因，用于重组DNA分子的筛选 21．(高二下·江西抚州·期末)科研人员构建可表达H-M3融合蛋白的重组质粒并导入受体细胞，该质粒的部分结构如图所示，其中M3编码序列表达标签短肽M3。下列有关叙述正确的是（ ）
A．为了使H基因和M3编码序列产生相同黏性末端，只能用同种限制酶进行切割 B．H基因和M3编码序列通过磷酸二酯键相连 C．图中H基因以甲链作为模板进行转录 D．为确定H基因定向连接到质粒中，可选择引物组合有9种 22．(高二下·江西景德镇·期末)如图是利用工程菌（大肠杆菌）生产人生长激素的实验流程。所用的pBR322质粒含有限制酶PstI、EcoRI和HinIⅢ的切点各一个，且三种酶切割形成的末端各不相同，假设用两种限制酶同时处理目的基因和质粒，而AmpR表示氨苄青霉素抗性基因，TetR表示四环素抗性基因。下列相关分析正确的是（ ）
A．目的基因就是指编码蛋白质的基因 B．图中选择了EcoRI和HindⅢ两种限制酶同时切割人生长素基因和质粒 C．含有目的基因的大肠杆菌在培养基乙和丙上的生存情况是在丙中能存活，在乙中不能存活 D．过程①所用到的组织细胞是人垂体组织细胞，③过程的目的是将平末端处理为黏性末端 23．(高二下·河北沧州泊头文宇中学·期末)无缝克隆技术（In-Fusion技术）是一种先进的DNA重组技术，用于将目标DNA片段插入载体中。其中In-Fusion酶可以连接任何具有相同15 bp（bp为碱基对）末端序列的线性DNA分子，过程如图所示。下列关于该技术的叙述正确的是（ ）
A．推测In-Fusion酶可替代限制酶和DNA连接酶用于构建重组载体 B．PCR扩增目的基因时，需在引物5'端添加与载体相同的特定序列 C．利用In-Fusion技术构建图示重组载体时，可避免目的基因与载体的反向连接 D．当目的基因内部有多种限制酶识别序列时，该方法将无法使用 24．(高二下·湖南岳阳·期末)FSHD是一种罕见的神经肌肉疾病，该病是由于DUX4基因突变产生对骨骼肌有毒的DUX4蛋白。研究发现利用反义疗法可治疗该病，即将DUX4的反义基因导入患病组织，从而达到抑制DUX4基因表达的目的。构建DUX4反义基因表达载体的过程如下图所示，已知DUX4的反义基因与DUX4基因的碱基序列相同，但转录的模板链不同。下列说法正确的是（ ）
A．DUX4反义基因通过抑制DUX4基因的转录过程来抑制DUX4基因的表达 B．可采用显微注射法将DUX4反义基因表达载体导入患病组织细胞 C．利用图中信息构建反义基因表达载体时，选择的限制酶应为Hind III和BamHI D．利用DUX4基因序列制备的引物进行PCR可检测DUX4反义基因是否导入受体细胞 三、解答题 25．(高二下·甘肃白银部分学校·期末)某基因工程中，质粒与目的基因的结构如图所示，相关限制酶的识别序列及切割位点如表所示。回答下列问题：
(1)将切割后的目的基因和质粒进行连接需要用到_______酶。 (2)标记基因的作用是________。检测发现某细胞中存在标记基因，是否说明该细胞已经成功导入目的基因？_______（填“是”或“否”），原因是________。 (3)通过上述过程得到的重组质粒是否均为目的质粒？________（填“是”或“否”），原因是________。 26．(高二下·重庆第一中学校·期末)反刍动物具有特殊的器官——瘤胃，瘤胃中恒定的温度和厌氧的环境为多种微生物提供了生长繁殖的有利条件。图1是从瘤胃中分离纤维素分解菌的流程图。回答下列问题：
（滚管培养：吸取一定体积的菌液注入盛有50℃左右液体状态的培养基的试管中，振荡均匀后将其平放于盛有冰块的盘中迅速滚动，这样带菌培养基在试管内壁立即凝固成一薄层，经培养后可在培养基内或表面长出肉眼可见的菌落。） (1)上述实验筛选的微生物的代谢类型为____；菌落特征可作为鉴定菌种的依据，常用的菌落特征包括 ____等（答出两点）。 (2)滚管培养法____（填“能”或“不能”）用于细菌计数；若不能，请说明理由，若能，请写出计算结果所需要知道的相关数据：____。 (3)分离出的某细菌（解淀粉芽孢杆菌）其W基因可编码一种高效降解纤维素的酶，为使大肠杆菌产生该酶，以图2中质粒为载体，进行转基因操作。不同限制酶的识别序列及切割位点如表所示。 ①W基因转录的模板链是____。启动子通常具有物种特异性，在质粒中插入W基因，其上游启动子应选择____的启动子。 ②在构建基因表达载体时，应使用限制酶____切割图中质粒，使用限制酶____切割图中含W基因的DNA片段。 27．(高二下·吉林长春长春汽车经济技术开发区第三中学·期末)抗冻蛋白基因TmAFP是从黄粉虫幼虫体内分离得到的基因，其编码的蛋白质具有很强的抗冻活性。科学家成功将TmAFP基因导入甘薯中，并使甘薯获得抗冻能力，减少霜冻对甘薯的损害，提高甘薯的产量和质量。图1为基因工程操作可能用到的6种限制酶的识别序列（箭头表示切割位点），图2表示培育抗冻甘薯新品种的流程。回答下列问题：
(1)获得的抗冻蛋白基因TmAFP可利用____技术大量扩增，其依据的原理是____。该过程需在含____的缓冲液中加入适量的模板DNA、分别与两条模板链结合的____、4种脱氧核苷酸及____等。 (2)过程②将构建的基因表达载体导入根瘤农杆菌之前，一般先用____处理农杆菌。 (3)分析图1信息，进行①过程前，选择限制酶____切割质粒P1，选择限制酶____切割抗冻蛋白基因TmAFP，这样可以防止质粒、目的基因自身环化和反向拼接。 (4)若要从个体生物学水平鉴定培育的转基因甘薯植株是否具有抗冻的特性，应进行的操作是_____。 28．(高二下·吉林白山五校·期末)有研究表明CDKN2B基因与小鼠的寿命有关，科学家将该基因导入小鼠体内，统计其寿命是否高于正常小鼠。图1表示CDKN2B基因与相关限制酶酶切位点，该基因转录出的mRNA碱基序列与A链的碱基序列相同（T、U视为相同的碱基），图2为质粒简图，回答下列问题：
(1)科学家首先采用PCR技术对目的基因进行扩增。PCR过程中每一循环有两次升温一次降温，其中降温的目的是_________。 (2)科学家在构建基因表达载体过程时，目的基因应插在_________和_________之间才能正常表达。单独使用限制酶HindⅢ分别切割目的基因和载体后产生黏性末端。携带CDKN2B基因的重组质粒成功导入细胞后，发现约一半的细胞中没有检测到CDKN2B蛋白，原因是_________。为了避免这种现象的发生，应对以上方法进行改进，改进措施为_________。 (3)若想让一个转入了目的基因的受精卵发育成多个个体，可以采用_________技术，该技术可以看作动物_________的方法之一、 29．(高二下·福建泉州四校联考·期末)MS2噬菌体是一种RNA病毒，其遗传物质由控制合成A蛋白、衣壳蛋白（CP）、复制酶（REP）等蛋白的基因组成。A蛋白和CP与MS2噬菌体颗粒（VLPs）的形成相关，颗粒中含REP，缺乏REP时噬菌体不能增殖形成噬菌斑。将逆转录得到的MS2基因组中的REP基因拆分成REP-a和REP-b基因片段，并将REP-a基因与X基因融合，将REP-b基因与Y基因融合，若X蛋白与Y蛋白之间存在相互作用，则会使REP-a蛋白与REP-b蛋白相互靠近并具备完整的REP活性，相关过程如下图。回答下列问题：
(1)若要通过PCR融合REP-a基因与X基因，关键是设计具有______（填“互补末端”或“不同末端”）的引物，使PCR产物在末端形成重叠链，在随后的PCR扩增中重叠链作为模板延伸，将两个片段拼接成一个完整的融合基因。重叠PCR中_______过程所需温度最低。若两个片段具有相同且合适的酶切位点，则可以借助_______酶将两个片段连接起来。 (2)质粒1中包含重组MS2噬菌体基因组，其中的REP基因编码区由REP-a基因与X基因替换，不含______段。质粒1的表达产物________与转录后形成的重组MS2噬菌体基因组RNA包装后形成VLPs。 (3)将得到的VLPs侵染含质粒2的MS2噬菌体宿主，并观察是否形成_________，图中培养基出现阳性结果，则说明__________。 30．(高二下·辽宁县域重点高中·期末)t-PA蛋白能降解血栓，是脑血栓患者的特效药，但其促进血栓溶解的特异性不高。若将t-PA蛋白第84位的氨基酸由半胱氨酸（密码子是UGU）替换成丝氨酸（密码子是UCU），获得改良的t-PA蛋白，其溶解血栓的效率明显提升。图1和图2为改造t-PA蛋白基因及构建表达载体的过程。回答下列问题：
(1)在PCR技术中高温变性的目的是_______，若PCR扩增没有获得扩增产物，下列解释合理的有_______。 ①复性温度过高②缓冲液中缺少镁离子③引物之间互补配对 (2)图1中黑点表示突变位点的碱基，若要得到改良t-PA蛋白，则引物b中该位点的碱基是5'-______-3'（写出3个碱基）。重叠延伸得到的改良t-PA蛋白基因非模板链序列为5'-TGAAACGCT…（中间序列）…GTCGGCTCG-3'。为了便于将扩增后的基因与质粒pCLY11成功构建成重组质粒，需在引物的5'端添加限制酶酶切序列，请写出PCR3扩增中引物a的碱基序列5'-_______-3'（写出15个碱基）。 (3)运用乳房生物反应器可以从转基因牛的乳汁中获得t-PA改良蛋白。将t-PA改良基因与_______启动子连接构建表达载体，通过_______法将重组质粒导入受精卵，将受精卵培养至______阶段时，可以进行胚胎分割。 (4)受精卵发育成的转基因母牛在进入______期后，从转基因牛的乳汁中提取t-PA，对t-PA进行活性检测时，应以t-PA溶液为阳性对照，以________为阴性对照。 31．(高二下·河北保定·期末)长期使用抗生素容易使致病菌产生严重的耐药性。抗菌肽以其抗菌活性、低耐药可能性、免疫调节特性和能够促进伤口愈合的潜在能力成为最有前景的抗菌药物之一。研究发现，将抗菌肽第52位的脯氨酸（密码子：CCA）替换成苏氨酸（密码子：ACA）可增强抗菌肽的杀菌活性。科研人员利用大引物PCR定点诱变技术对抗菌肽基因进行改造的过程如图甲所示，使其在大肠杆菌细胞内表达，可制造出改良t-PA蛋白。图乙表示相关的目的基因、载体及限制酶。PCLY11为质粒，新霉素和四环素为抗生素。回答下列问题：
(1)将抗菌肽第52位的脯氨酸换成苏氨酸，需要将mRNA对应碱基序列中第______位的碱基替换掉，基因转录模板链上相应位点碱基的变化为______。 (2)由图甲分析，大引物PCR定点诱变技术中，设计的诱变引物的碱基序列为5'-______（写出8个碱基）-3'。利用大引物PCR进行定点诱变需要进行两轮PCR（PCR1和PCR2），在PCR1中，至少需要______个循环才能获得相应的大引物模板。 (3)据图乙分析，应选择限制酶______切割PCLY11，才能使其与改良t-PA蛋白基因高效连接。改良t-PA蛋白基因与质粒PCLY11构建基因表达载体时，需要用DNA连接酶催化______键的形成。 (4)在筛选过程中，应该选择不含______（填基因种类）的大肠杆菌作为受体细胞，以便在选择培养基中筛选出导入了重组基因表达载体的大肠杆菌。 32．(高二下·辽宁葫芦岛·期末)科学家欲从紫苏中提取DGAT1基因（催化油脂合成的关键酶基因），导入到四尾栅藻细胞，获得转基因油脂高产四尾栅藻，质粒pCAMBIA与PCR扩增出的DGAT1酶切位点如图所示。现有BamHI、BglⅡ、EcoRI三种限制酶，它们识别并切割的碱基序列如下（↓表示切割位置）。
回答下列问题： (1)过程①需要______酶的催化，过程②通过PCR技术实现，在PCR体系中，添加引物的序列不能过短，否则会导致其特异性_______（填“降低”或“升高”）。进行PCR时，需要在两种引物的_________端（5'/3'）添加限制酶BglⅡ的识别序列。 (2)用限制酶BglⅡ切割DGAT1，用限制酶_____切割pCAMBIA，将充分酶切后的产物混合，加入DNA连接酶进行连接。 (3)回收电泳凝胶中大小约为_______bp的DNA对大肠杆菌进行转化，用含有______的培养基进行筛选并提取重组质粒。最终获得的重组质粒不一定符合要求，原因是_____。 (4)转基因技术在动植物领域、微生物领域均已取得广泛的成果，下列有关转基因技术的叙述，正确的是_____。 ①我国对农业转基因生物实行了标识制度 ②转基因技术本身是中性的，应理性看待该技术 ③转基因植物的基因来自自然界，不会产生安全性问题 ④只要有证据表明转基因产品有害，就应该禁止转基因技术的应用 |
