（1）Ti质粒上与其在农杆菌中的复制能力相关的结构为_____。选用图甲中的SmaI对抗除草剂基因X进行完全酶切，再选择SmaI和_____对Ti质粒进行完全酶切，将产生的黏性末端补平，补平时使用的酶是_____。利用DNA连接酶将酶切后的包含抗除草剂基因X的片段与酶切并补平的Ti质粒进行连接，构建重组载体，转化大肠杆菌；经卡那霉素筛选并提取质粒后再选用限制酶_____进行完全酶切并电泳检测，若电泳结果呈现一长一短2条带，较短的条带长度近似为_____bp，则一定为正向重组质粒。
（2）为证明这两个突变体是由于T-DNA插入到小麦基因组中同一基因导致的，提取基因组DNA，经酶切后产生含有T-DNA的基因组片段（图乙）。在此酶切过程中，限于后续PCR难以扩增大片段DNA，最好使用识别序列为_____（填“4”“6”或“8”）个碱基对的限制酶，且T-DNA中应不含该酶的酶切位点。需首先将图乙的片段_____，才能利用引物P1和P2成功扩增未知序列。PCR扩增出未知序列后，进行了一系列操作，其中可以判断出2条片段的未知序列是否属于同一个基因的操作为_____（填“琼脂糖凝胶电泳”或“测序和序列比对”）。
（3）通过农杆菌转化法将构建的含有野生型基因的表达载体转入突变植株，如果检测到野生型基因，_____（填“能”或“不能”）确定该植株的表型为野生型。
【答案】
（1） 复制原点 XbaI DNA聚合酶 SmaI和SpeI 550bp
（2） 4 环化 测序和序列比对
（3）不能
【论证分析】
（1）第一空：DNA复制的起点是复制原点，因此Ti质粒上与其在农杆菌中的复制能力相关的结构为复制原点。
第二空、第三空：
切割质粒选择限制酶的依据：
根据SmaI限制酶识别序列可知，酶切形成的是平末端，若质粒仅用SmaI酶切，抗除草剂基因可以正向插入也可以反向插入质粒，且无法区分，为了确定是否是正向重组质粒，因此在构建重组质粒时需要用到另一种限制酶，抗除草剂因需要插入到启动子和终止子之间。
不能选择BamHI，因为该限制酶会破坏终止子，可选择XbaI和SmaI进行酶切，XbaI酶切会形成黏性末端，需要用DNA聚合酶聚合脱氧核糖核苷酸单体将产生的黏性末端补平（可使重组质粒最小，同时PstI酶切后产生的黏性末端无法用DNA聚合酶抹平，因为DNA聚合酶只能从3'延伸子链）。
XbaI和SmaI切割后产生的黏性末端见上图
切割含抗除草剂基因X的DNA片段选择限制酶的依据：
切割质粒用SmaI和XbaI，XbaI切割后产生的黏性末端加入DNA聚合酶补齐，SmaI切割后产生的是平末端；切割后抗除草剂基因X的DNA片段要保证完整，且能与带缺口的质粒连接，应选择SmaI。
第四空：
用DNA连接酶将酶切后的包含抗除草剂基因X的DNA片段与酶切并补平的Ti质粒进行连接，构建重组载体，转化大肠杆菌。重组T-DNA片段上含有一个SmaI酶切位点和一个SpeI酶切位点，可以选择用SmaI和SpeI进行酶切，详见上图。经过两种酶切割后并电泳呈现一长一短2个条带，若正向连接，较短的条带长度近似为550bp；若反向连接，较短的条带长度近似为200bp。
（2）解析
由于后续PCR难以扩增大片段DNA，所以最好选择识别序列为4个碱基的限制酶，原因是识别序列越短，特异性越差，酶切位点越多，切割产生的片段可能越小，更有利于后续PCR扩增。由于引物是根据已知序列设计的，但此时需要扩增未知序列，因此可以将图乙的片段环化，这样就可以利用现有引物扩增出未知序列。为了确定未知序列是否是同一基因，需要准确比对其上的碱基序列，因此对同一个基因的操作为测序和序列比对。
（3）解析
突变植株成功导入野生型基因，但野生型基因未必可以正常表达，因此不能确定该植株的表型为野生型。
2.（2024山东高考真题25）研究发现基因L 能够通过脱落酸信号途径调控大豆的逆境响应。利用基因工程技术编辑基因L，可培育耐盐碱大豆品系。在载体上的限制酶BsaI切点处插入大豆基因L的向导 DNA序列，将载体导入大豆细胞后，其转录产物可引导核酸酶特异性结合基因组上的目标序列并发挥作用。载体信息、目标基因L部分序列及相关结果等如图所示。（528字）
（1）用PCR技术从大豆基因组DNA中扩增目标基因L时，所用的引物越短，引物特异性越 （填“高”或“低”)。限制酶在切开DNA双链时，形成的单链突出末端为黏性末端，若用BsaI酶切大豆基因组 DNA，理论上可产生的黏性末端最多有 种。载体信息如图甲所示，经BsaI酶切后，载体上保留的黏性末端序列应为5'-____-3'和5'-______-3'。
（2）重组载体通过农杆菌导入大豆细胞，使用抗生素 _____筛选到具有该抗生素抗性的植株①~④。为了鉴定基因编辑是否成功，以上述抗性植株的DNA为模板，通过PCR扩增目标基因L，部分序列信息及可选用的酶切位点如图乙所示，PCR产物完全酶切后的电泳结果如图丙所示。据图可判断选用的限制酶是_____ ，其中纯合的突变植株是 _____（填序号）。
（3）实验中获得1株基因L成功突变的纯合植株，该植株具有抗生素抗性，检测发现其体细胞中只有1条染色体有T-DNA插入。用抗生素筛选这个植株的自交子代，其中突变位点纯合且对抗生素敏感的植株所占比例为 _____，筛选出的敏感植株可用于后续的品种选育。
【答案】
(1)低 256（或44） ATTG AAAC
(2)卡那霉素 Sacl ④
(3)1/4
【试题立意】本题以利用基因工程技术编辑基因L培育耐盐碱大豆品系为学习探究情境，考查基因工程的工具限制酶的使用、PCR技术扩增、遗传分离定律等内容。
【论证分析】
（1）第一空：
由教材内容可知，在利用PCR技术从大豆基因组DNA中扩增目的基因时，所用的引物越短，则引物的特异性就越低。
（1）第二空：
根据题意可知，BsaI酶限制酶在切开DNA双链时，形成的单链末端为黏性末端，有4个未知碱基（AGCT），若用BsaI酶切大豆基因组DNA，因此最多可产生44种黏性末端。
（1）第三空：
根据图甲所示的载体信息，BsaI酶有如图所示两段切割序列，根据BsaI酶的作用，切割后载体上保留的黏性末端序列应为5'-ATTG-3'和5'-AAAC 3'。
（2）第一空：
根据图示信息可知，重组载体通过农杆菌导入大豆细胞当中的片段包含了卡那霉素抗性基因，因此可以通过使用卡那霉素筛选到具有该抗生素抗性的植株。
（2）第二空：
根据图甲可知，目标基因L的目标序列跟突变序列之间的差异只有在Sac Ⅰ酶切位点上存在差异，BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ这两个酶切位点完全相同。根据图丙及题意可知，所展示的电泳结果可知，要以上述抗性植株的DNA为模板，通过PCR扩增目标基因L，并对PCR产物完全酶切后进行电泳从而判断植株含有的是目标序列还是突变序列，因此只能选用限制酶SacⅠ。
（2）第三空：
限制酶Sac Ⅰ在突变序列存在酶切位点，但是目标序列没有，因此经过该酶酶切后突变序列的电泳条带会出现两条，目标序列是一条带，根据图丙结果可知，只有④为纯和突变的植株。
（3）第一空：
根据题意可知，在实验当中获得了一株基因l成功突变的纯合之中，已知该植株具有抗生素抗性，经过检测却发现其体细胞中只有一条染色体含有T-DNA插入。
根据图示可知，抗生素抗性基因在T-DNA片段上，因此如果用抗生素来筛选该植株进行自交，可知其配子中含有抗生素抗性基因的比例为1/2，不含T-DNA（对抗生素敏感）的配子比例为1/2，因此突变位点纯合且对抗生素敏感的植株所占比例应该为1/2×1/2=1/4，纯突变位点纯合且具有抗生素抗性的植株所占比例应该为3/4，可以筛选出的敏感植株可用于后续的品种选育。
3.（2023·山东·高考真题）科研人员构建了可表达J-V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测，该质粒的部分结构如图甲所示，其中V5编码序列表达标签短肽V5。
（1）与图甲中启动子结合的酶是____。除图甲中标出的结构外，作为载体，质粒还需具备的结构有______（答出2个结构即可）。
（2）构建重组质粒后，为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR检测，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物___________。已知J基因转录的模板链位于b链，由此可知引物F1与图甲中J基因的_________（填“a链”或“b链”）相应部分的序列相同。
（3）重组质粒在受体细胞内正确表达后，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水平，结果如图乙所示。其中，出现条带1证明细胞内表达了__________，条带2所检出的蛋白______________（填“是”或“不是”）由重组质粒上的J基因表达的。
【答案】
（1） RNA聚合酶 限制酶切割位点、标记基因、复制原点等
（2） F2和R1或F1与R2 a链
（3） J-V5融合蛋白 不是
【论证分析】
该题考查融合基因的构建、表达和检测。
【第（1）问】
选必3教材P80:启动子是一段特殊序列结构的DNA片段，位于基因的上游，紧挨转录的起始位点，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRN，最终表达出人类所需要的蛋白质。怎样才能质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核 DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。作为运载体必须具备的条件：①质粒DNA分子上有一个至多个限制酶切割位点，供外源DNA片段(基因)插入其中。②携带外源DNA片段的质粒进入受体细胞后，能在细胞中进行自我复制，或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制。在基因工程操作中，真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。③这些质粒上常有特殊的标记基因，如四环素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因等，便于重组DNA分子的筛选。④是安全的，对受体细胞无害，而且要易从供体细胞分离出来，图中甲有启动子和终止子等，因此质粒还需具备的结构有限制酶的切割位点、标记基因、复制原点等。
【第（2）问】
若选择（1）F2与R1（2）F1与R2
据图甲可知，引物F2与R1或F1与R2结合部位包含J基因的碱基序列，而且只有当J基因连接到质粒中，且插入方向正确，进行PCR检测时，才能扩增出J基因（若J基因反向连接，引物F2与R1或引物F1与R2在同一条链上，无法对J基因扩增），因此，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物F2和R1或F1与R2。
若选择F1与R1 ，J基因无论正向连接，还是反向连接，都能进行扩增；若选F2与R2 ，有没有扩增出J基因无法得知。
若b是转录模板链，根据上图启动子和终止子的位置，可确定转录方向是从左向右，基因模板链方向应该是从左向右3’-5'，非模板链从右向左（也就是a链）是5'-3'；DNA复制时，子链延伸的方向为5’-3'，引物结合在模板链3’，图中F1是前引物，应在左侧，所以其配对的单链是从左向右方向为3’-5'的b链，故其序列应该与a链相应部分的序列相同。注意：无论是复制，还是转录，模板链都是3’-5'，产物是从5'-3'，因为无论是复制，还是转录，只能在3'聚合单核苷酸。
【第（3）问】
J-V5融合蛋白的重组质粒，既能表达J蛋白，又能表达V5蛋白。抗原能与抗体发生特异性结合，据图乙可知，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测，均出现条带1，说明条带1是J-V5融合蛋白。抗J蛋白抗体检测出现条带2，抗V5抗体检测不出现条带2，说明条带2，只发生V5基因的表达，所检出的蛋白不是由重组质粒上的J基因表达的。
值得注意（2023·山东·高考真题T22）第（3）问最后一空：
某二倍体两性花植物的花色由2对等位基因A、a和B、b控制，该植物有2条蓝色素合成途径。基因A和基因B分别编码途径①中由无色前体物质M合成蓝色素所必需的酶A和酶B；另外，只要有酶A或酶B存在，就能完全抑制途径②的无色前体物质N合成蓝色素。已知基因a和基因b不编码蛋白质，无蓝色素时植物的花为白花。相关杂交实验及结果如表所示，不考虑其他突变和染色体互换；各配子和个体活力相同。
（3）已知基因B→b只由1种染色体结构变异导致，且该结构变异发生时染色体只有2个断裂的位点。为探究该结构变异的类型，依据基因B所在染色体的DNA序列，设计了如图所示的引物，并以实验一中的甲、乙及F2中白花植株（丙）的叶片DNA为模板进行了PCR，同1对引物的扩增产物长度相同，结果如图所示，据图分析，该结构变异的类型是_____。丙的基因型可能为_____；若要通过PCR确定丙的基因型，还需选用的1对引物是_____。
第三空：
①由引物F1/R1扩增后甲乙均有产物，且长度相等，可推出倒位区域位于引物F1、R1之间；
②由引物F2/R2扩增后甲乙均有产物，且长度相等，可推出倒位区域位于引物F2、R2之外；
由①②可得，2个断点分别位于引物F1、F2之间和引物R1、R2之间。
即：颠倒区域如图红色框内，如下图：
图1：颠倒前（B，红框内为倒位位置）
根据电泳结果判断是F2和R2对应的DNA片段发生了倒位，使得基因B突变为b，倒位后获得的b基因，F1/R2引物对应的是同一条单链，F2/R1引物对应的是同一条单链，因此用F2/R1扩增，乙植物无法扩增出产物。
图2：颠倒后（B→b）
为了确定丙的基因型，即确定是否含有b基因，可以选择引物F1/F2或R1/R2，由于B基因F1/F2引物对应的是同一条单链，R1/R2对应的另一条单链，因此无法扩增，而由于倒位，b基因可以正常扩增。
4.（2022·山东·高考真题）某种类型的白血病由蛋白P引发，蛋白UBC可使P被蛋白酶识别并降解，药物A可通过影响这一过程对该病起到治疗作用。为探索药物A治疗该病的机理，需构建重组载体以获得融合蛋白FLAG-P和FLAG-P△。P△是缺失特定氨基酸序列的P，FLAG是一种短肽，连接在P或P△的氨基端，使融合蛋白能与含有FLAG抗体的介质结合，但不影响P或P△的功能。
(1)为构建重组载体，需先设计引物，通过PCR特异性扩增P基因。用于扩增P基因的引物需满足的条件是_____ 、为使PCR产物能被限制酶切割，需在引物上添加相应的限制酶识别序列，该限制酶识别序列应添加在引物的 _____（填“3'端”或“5'端”）。
(2)PCR扩增得到的P基因经酶切连接插入载体后，与编码FLAG的序列形成一个融合基因，如图甲所示，其中“ATGTGCA”为P基因编码链起始序列。将该重组载体导入细胞后，融合基因转录出的mRNA序列正确，翻译出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正确，但P基因对应的氨基酸序列与P不同。据图甲分析，出现该问题的原因是_____ 。修改扩增P基因时使用的带有EcoRⅠ识别序列的引物来解决该问题，具体修改方案是_____ 。
(3)融合蛋白表达成功后，将FLAG-P、FLAG-P△、药物A和UBC按照图乙中的组合方式分成5组。各组样品混匀后分别流经含FLAG抗体的介质，分离出与介质结合的物质并用UBC抗体检测，检测结果如图丙所示。已知FLAG-P和FLAG-P△不能降解UBC，由①②③组结果的差异推测，药物A的作用是_____ ；由②④组或③⑤组的差异推测，P△中缺失的特定序列的作用是 _____。
(4)根据以上结果推测，药物A治疗该病的机理是 _____。
【答案】
(1) 能与P基因母链的一段碱基序列互补配对、短单链核酸 5'端
(2) P基因编码链的第一个碱基与EcoRⅠ识别序列的最后两个碱基编码一个氨基酸，导致mRNA的密码子被错位读取 在引物中的EcoRⅠ识别序列3'端添加1个碱基
(3) 增强FLAG-P与UBC的结合 参与P与UBC的结合
(4) 药物A通过增强P与UBC结合促进P降解
【论证分析】
【第（1）问】
引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核苷酸，因此设计扩增P基因的引物，需要两种引物分别与两条模板链3'端的碱基序列互补。DNA聚合酶延伸时，是将脱氧核苷酸加到引物的3'端，为了确保正常扩增目的基因，该限制酶识别序列应添加在引物的5'端，即扩增后的DNA片段，限制酶的识别序列应在目的基因两端。
知识链接：
1.什么是引物？
引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。用于PCR的引物长度通常为20~30个核苷酸。
2.引物有什么作用？
引物准确对片段扩增的关键。引物的作用是识别(定位)目的基因的核苷酸序列，由于Taq酶不能从头合成DNA链，只能从引物的3’端延伸子链，引物与模板链的3’端通过碱基互补配对结合，并使耐高温的DNA聚合酶从引物的3'端连接脱氧核苷酸，且需两种引物分别匹配目的基因两条模板链的两端，保证扩增片段的特异性。一句话：引物的种类(碱基序列)、组合与模板链的结合位置决定了扩增产物的大小。
3.为什么要在引物上添加限制酶识别序列？如何选择？
为将扩增后的产物定向插入载体并发挥作用，需在引物 5’端添加限制酶识别序列，该序列经酶切形成的末端应在载体中也存在,以便使扩增产物与载体形成相同的黏性末端而连接在一起。
（1）选择合适的限制酶：
依据载体上的多克隆位点（MCS）选择限制酶（如载体含EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位点，可对应选择这两种酶）。
关键原则：①限制酶识别序列不能存在于目的基因内部（否则会切割目的基因）；②避免选择识别序列过短（如4bp）的酶，减少非特异性切割。
（2）确定附加序列的位置和方向：
位置：严格添加在引物的 5’端（不能添加在3’端，耐高温的DNA聚合酶从引物的3'端连接脱氧核苷酸。）
方向：限制酶识别序列是回文结构，需按“5’→3’”方向书写（如EcoRⅠ的识别序列需写成 5’-GAATTC-3’ ，不能反向）。
（3）设计完整引物序列：
完整引物 = 5’端附加序列（限制酶识别序列）+ 3’端目的基因互补序列。
例：若目的基因3’端互补序列为5’-CGTACG-3’，选择EcoRⅠ（识别序列GAATTC），则完整引物为5’-GAATTC-CGTACG-3’（连接符仅为区分，实际无间隔）。
（4）添加保护碱基：
原因：限制酶切割时需结合DNA双链的一定长度区域，仅添加识别序列可能导致切割效率低。
操作：在限制酶识别序列的5’端 再添加2-3个随机碱基（如GGC），示例：5’-GGC-GAATTC-CGTACG-3’；最终形成“保护碱基+识别序列+目的基因互补序列”的结构。
【第（2）问】
此题考查基因的翻译过程，mRNA中密码子与氨基酸的对应关系。融合基因转录出的mRNA序列正确，翻译出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正确，但P基因对应的氨基酸序列与P不同，说明P基因翻译时出错。由图可知，在转录出的mRNA中，限制酶识别序列对应的最后两个碱基与P基因对应的第一个碱基构成一个密码子，导致读码框改变，翻译出的氨基酸序列改变，可通过在EcoRⅠ识别序列3'端添加1个碱基，使其碱基数目加上FLAG的碱基数目为3的倍数，这样能保证P基因转录出的mRNA上的读码框不改变，能够正常翻译。
【第（3）问】
由题干可知：各组样品混匀后分别流经含FLAG抗体的介质，推测含有FLAG的样品才能与FLAG抗体的介质结合；分离出与介质结合的物质并用UBC抗体检测，含有UBC的样品才能与UBC抗体结合，出现杂交带，综合以上两点，图丙出现杂交带的应为含有FLAG与UBC的样品。
实验分析：明确实验自变量与因变量。
①组仅添加UBC，处理后，用UBC抗体检测，不出现杂交带；
②组添加UBC和FLAG-P，出现杂交带；
③组添加UBC、药物A和FLAG-P，杂交带更加明显，说明药物A的作用是促进UBC与FLAG-P的结合。；
由②④组或③⑤组的差异在于②③组使用FLAG-P，出现杂交带；
④⑤组使用FLAG-P△，不出现杂交带，据此推测P△中缺失的特定序列是与UBC结合的关键序列。
此问考查抗原与抗体的特异性结合，逻辑推理能力。
5.（2021·山东·高考真题）人类γ基因启动子上游的调控序列中含有 BCL11A 蛋白结合位点，该位点结合 BCL11A 蛋白后，γ基因的表达被抑制。通过改变该结合位点的序列，解除对γ基因表达的抑制，可对某种地中海贫血症进行基因治疗。科研人员扩增了γ基因上游不同长度的片段，将这些片段分别插入表达载体中进行转化和荧光检测，以确定 BCL11A 蛋白结合位点的具体位置。相关信息如图所示。
（1）为将扩增后的产物定向插入载体指导荧光蛋白基因表达，需在引物末端添加限制酶识别序列。据图可知，在 F1～F7末端添加的序列所对应的限制酶是_____ ，在 R 末端添加的序列所对应的限制酶是 _____ 。本实验中，从产物扩增到载体构建完成的整个过程共需要 _____种酶。
（2）将构建的载体导入除去 BCL11A 基因的受体细胞，成功转化后，含 F1～F6与 R 扩增产物的载体表达荧光蛋白，受体细胞有荧光，含 F7与 R 扩增产物的受体细胞无荧光。含 F7 与 R 扩增产物的受体细胞无荧光的原因是 _____。
（3）向培养液中添加适量的雌激素，含 F1～F4与 R 扩增产物的受体细胞不再有荧光，而含 F5～F6与 R 扩增产物的受体细胞仍有荧光。若γ基因上游调控序列上与引物序列所对应的位置不含有 BCL11A 蛋白的结合位点序列，据此结果可推测，BCL11A 蛋白结合位点位于_____，理由是_____ 。
【答案】
（1） SalI EcoRI 6
（2） F7与R扩增产物不含完整的启动子，荧光蛋白基因不表达
引物 F4 与 F5 在调控序列上所对应序列之间的区段上 根据有无荧光情况判断，F1～F4 与 R 扩增产物上均有结合位点，因此结合位点位于 F4 所对应调控序列的下游（右侧）；F5～F6 与 R 扩增产物上均无结合位点，可知结合位点位于 F5 所对应调控序列的上游（左侧），所以结合位点位于引物 F4 与 F5 在调控序列上所对应序列之间的区段上。
【解析】
【第（1）问】
依据载体和目的基因上的限制酶切位点选择合适的限制酶
1.切割载体的限制酶的选择依据：
①将载体切割，但不能破坏荧光蛋白基因，
②切点要在荧光蛋白基因右侧，左侧含有终止子。
根据以上信息，排除NheI、EcoRI两种酶，可以使选择MunI、XhoI；
2.调控序列及启动子限制酶的选择依据：
由于其上含有Mun I、XhoI两种酶切割位点,因此不能使用这两种酶，载体使用Mun I、XhoI两种酶割，要定向将扩增序列插入两种酶切片段之间，且要保证F1~F7末端插入载体右侧XhoI切点，分析供选限制酶的识别序列及切割位点可知 SalI与XhoI为同尾酶，切割得到的黏性末端可以连接，故可以用SalI 代替 Xho I切割扩增序列。同样R段需与载体的Mun I酶切点连接，MunI与EcoRⅠ为同尾酶，酶可用酶EcoRⅠ代替酶Munl切割调控序列及启动子。
3.从产物扩增到载体构建完成需要酶的种类：
（1）产物扩增需要Taq酶（耐高温的DNA聚合酶）；
（2）切割有调控序列及启动子的DNA片段需用EcoⅠ和SalI；
（3）切割载体需用MunI和XhoI；
（4）载体与DNA连接需要DNA连接酶；
综上所述，完成整个过程共需要上述6种酶： Taq酶（耐高温的DNA聚合酶）、 EcoⅠ、SalI、MunI、XhoI、DNA连接酶。
【第（2）问】
据题意可知，需要将扩增后的产物（调控序列及启动子）定向插入载体，并指导荧光蛋白基因的表达，则扩增后的产物读取方向应与荧光蛋白基因的读取方向一致，故扩增后的产物中的R端与荧光蛋白基因右端限制酶MunⅠ识别序列端连接，F1--F7端与荧光蛋白基因右端识别序列端XhoI连接，才能保证扩增后的产物定向插入并指导荧光蛋白基因的表达。将扩增片段插入载体后图示如下，含 F7与R扩增产物的受体细胞无荧光说明荧光蛋白基因不表达，结合含 F1~F6与R扩增产物的载体能表达荧光蛋白以及引物 F7与R扩增产物最短，可以分析得到原因是 F7与R扩增产物不含完整的启动子，所以荧光蛋白基因不表达，导致含 F7与R扩增产物的受体细胞无荧光。
（基因表达载体）
【第（3）问】
向培养液中添加适量的雌激素后，雌激素诱导P启动子发挥作用，使BCLIIA基因表达出BCLIIA蛋白，含F1~F4与R扩增产物的受体细胞不再有荧光，说明 F1~F4与R扩增产物上均有BCLIIA蛋白结合位点，因此，结合位点位于 F4所对应的调控序列的下游（题干中图示F4右侧）；F5~F6与R扩增产物的受体细胞仍有荧光，说明 F5~F6与R扩增产物上均无结合位点，可知结合位点位于F5所对应调控序列的上游（题干图示F5左侧），所以结合位点应位于引物 F4与 F5在调控序列上所对应序列之间的区段上。
6.（2020·山东·高考真题）水稻胚乳中含直链淀粉和支链淀粉，直链淀粉所占比例越小糯性越强。科研人员将能表达出基因编辑系统的DNA序列转入水稻，实现了对直链淀粉合成酶基因（Wx基因）启动子序列的定点编辑，从而获得了3个突变品系。
（1）将能表达出基因编辑系统的DNA序列插入Ti质粒构建重组载体时，所需的酶是_____， 重组载体进入水稻细胞并在细胞内维持稳定和表达的过程称为_____ 。
（2）根据启动子的作用推测，Wx基因启动子序列的改变影响了 _____，从而改变了 Wx基因的转录水平。与野生型水稻相比，3个突变品系中Wx基因控制合成的直链淀粉合成酶的氨基酸序列 _____ (填：发生或不发生)改变，原因是_____ 。
（3）为检测启动子变化对Wx基因表达的影响，科研人员需要检测Wx基因转录产生的mRNA （Wx mRNA）的量。检测时分别提取各品系胚乳中的总RNA，经 过程获得总 cDNA。通过PCR技术可在总cDNA中专一性的扩增出 Wx基因的cDNA，原因是_____。
（4）各品系Wx mRNA量的检测结果如图所示，据图推测糯性最强的品系为_____，原因是_____。
【答案】
（1）限制性核酸内切酶和DNA连接酶 转化
（2） RNA聚合酶与启动子的识别和结合 不发生 编码直链淀粉合成酶的碱基序列中不含启动子
（3）逆转录（或：反转录） 引物是根据Wx基因的一段已知序列设计合成（或：引物能与Wx基因的cDNA特异性结合）
(4)品系3 品系3的Wx mRNA最少，控制合成的直链淀粉合成酶最少，直链淀粉合成量最少，糯性最强
【难度】0.65
【知识点】将目的基因导入受体细胞、基因表达载体的构建、目的基因的筛选、获取、DNA重组技术的基本工具
【分析】基因工程的操作步骤：
1、获取目的基因（从基因组文库中获取、利用PCR技术扩增目的基因、化学合成法）；
2、基因表达载体的构建（这也是基因工程的核心）；一个完整的基因表达载体包括：
（1）启动子：位于基因的首端，是RNA聚合酶识别并结合的位点，驱动目的基因的转录；（2）目的基因：编码蛋白质的基因；（3）终止子：位于基因的尾端，其作用使转录在需要的地方停止；（4）标记基因：作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的受体细胞筛选出来。
3、将目的基因导入受体细胞（植物、动物、微生物）：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程，称为转化。
4、目的基因的检测与鉴定 （DNA分子杂交技术,分子杂交技术、抗原抗体杂交）。
【详解】
（1）将目的基因与Ti质粒构建基因表达载体时，需要限制酶的切割，将目的基因插入载体时需要DNA连接酶的连接，重组载体进入水稻细胞并在细胞内维持稳定和表达的过程叫做转化。
（2）根据以上分析可知，启动子是RNA聚合酶识别并结合的位点，如果启动子序列改变将会影响RNA聚合酶与之结合和识别，进而影响基因的转录水平。在真核生物中，编码蛋白质的序列是基因中编码区，编码区中不包括启动子序列，因此直链淀粉合成酶的基因碱基序列中不含有启动子，因此3个突变品系中Wx基因中控制合成直链淀粉酶的氨基酸序列不发生改变。
（3）以mRNA为模板合成cDNA的过程为逆转录，利用PCR技术扩增Wx基因的cDNA，需要以Wx基因合成的引物，这样引物能够在总cDNA中与Wx基因的cDNA特异性结合，从而利用PCR扩增技术专一性扩增出Wx基因的cDNA。
（4）识图分析可知，图中品系3的Wx基因的mRNA的含量最少，那么合成的直链淀粉酶最少，直链淀粉合成量最少，因此该水稻胚乳中含的直链淀粉比例最小，糯性最强。
【点睛】本题考查基因工程的知识点，要求学生掌握基因工程的操作工具和操作步骤是解决问题的关键。识记并理解基因工程中工具酶的种类和作用，把握基因表达载体构建的过程，理解启动子的功能和编码蛋白质的基因的结构，这是该题考查的难点；把握PCR扩增技术的操作过程和引物的作用，这是突破第（3）问的关键。
